PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：
1、引物長(zhǎng)度約為16-30 bp， 太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長(zhǎng)則比較浪費(fèi)，且難以合成。
2、引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。
3、四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。
4、引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。
5、在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。
6、兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ)， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在 4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
7、引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物su、熒光素等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。
8、引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無(wú)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。
9、簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡(jiǎn)并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。
10、一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L。引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體， 過(guò)低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì)， 可精確計(jì)算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計(jì)算：
X mol/L= OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。
